“四院院士”谢晓亮:怎么快速找到新冠“杀器”

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“通过单细胞基因组学,咱们能够快速精准地挑选出许多优质的中和抗体。”谢晓亮泄漏,北京大学联合佑安医院、我国医学医科院动物所、义翘神州等协作单位正在谋划后续动物试验,之后还将进行临床试验。而这些中和抗体至少有三重运用含义。其一,能够用于新冠肺炎中和抗体医治,“更安全且针对性强”。其二,能够用于短期防备,“有用期约为三周,经改造或许延伸至三个月”。其三,这种办法为未来或许呈现的疫情做好了技能预备。

以下为讲演内容全文:

谢晓亮:单细胞基因组学迎战新冠肺炎

首要,我想借此机会,衷心感谢英豪的武汉公民,向一线的医护作业者们致以崇高的敬意。我有两个朋友也加入了援鄂医疗队,我十分敬仰他们。

今晚的科普讲座,我想跟咱们共享的是,作为后方的科学作业者,咱们怎样通过单细胞基因组学迎战新冠肺炎。

新冠肺炎席卷全球,操控疫情触及四个方面:检测、阻隔、防备和医治。依据曩昔几个月国内外疫情的开展,咱们应该现已充沛知道到了检测和阻隔的重要性,我今日的讲演首要触及防备和医治。

谈到防备,人们纷繁把期望寄托在疫苗上。眼下全世界许多科学家正在研制疫苗,估量要年末才干出来。在疫苗出来之前,除了阻隔,咱们还能做什么呢?世界急需的是强有用的医治办法,来下降逝世率,可是现在还没有特效药。

从上星期中欧抗疫沟通会上和前几天的临床成果,咱们了解到,小分子药物氯奎和羟氯奎在轻症患者上有必定作用,现在美国也开端运用了。小分子药物,也便是化学组成药物,一般研制周期很长,比方说十年。所以现在都是旧药新用,药效有限。

除小分子药物外,血浆疗法也初见成效。血浆疗法便是把恢复期患者的血浆离心,取上层明澈的血浆部分打针给患者。这是一种传统疗法,现在在美国等国家也开端运用。

血浆疗法虽好,但有必定危险,由于血浆因人而异,是一个杂乱的混合物;并且血浆来历有限,不或许大规模运用。

恢复期患者的血浆中的要害成份是免疫系统发作的某种抗体。抗体是一种蛋白质,它的分子量是氢原子的15万倍。一切抗体都有Y字形状的结构,像两把“钳子”,用来捕捉抗原。那对咱们来说,抗原便是新冠病毒。

新冠病毒是一种RNA 病毒,它的外壳上有刺突状的S蛋白。S蛋白上面的赤色的部分是冠状病毒的受体结合域(Receptor Binding Domain, RBD)。

新冠病毒侵略细胞时,S蛋白与人体细胞的外表受体ACE2结合,随后病毒被内化,进入细胞,在细胞内被转录酶仿制,从头拼装成许多新的病毒,又去继续感染其他细胞。

抗体有许多种,咱们关怀的是中和抗体。中和的意思就像酸来了,咱们用碱来中和;病毒来了,细胞用抗体来中和。中和抗体的作用是牢牢地结合到病毒上,改动它的功用,阻挠它侵入细胞。咱们的方针是快速找到并制备高纯度中和抗体,作为药物,替代血浆给患者打针。

抗体药物是一种大分子药物,与小分子药物比较,它的特异性好,副作用小,近年来有不少成功的比方。

艾滋病原来是不治之症,2018年今后美国FDA赞同HIV的抗体药物,与其他抗病毒逆转录的药物联合运用。

针对埃博拉病毒,三种单克隆抗体已获美国FDA赞同,现在正在临床开发中。2015年,由军事医学科学院研制的抗体药物MIL77成功治好1名确诊埃博拉病毒的感染者。

还有中东呼吸综合征(MERS), 2018年通过基因改造的牛出产的针对MERS病毒的人类抗体,在一期临床试验中体现杰出。二期临床由于疫情消失无法继续。

以上这三种抗体药物都是中和抗体。但问题是找到这些抗体的时刻太长。选用的是单细胞克隆扩大的办法,需求几个月。咱们现在被逼着缩短这个时刻。

我这儿趁便提一下癌症。截止2018年,全球将近500个抗体新药进入临床试验。它们不是中和抗体,而是与T细胞有关的抗体。其间以PD-1/PD-L1为靶点的抗体是研讨热门。

回到咱们的课题:怎样快速找到并制备高纯度的中和抗体?

血浆中的抗体不可胜数,品种约有10的7~8次方之多。想在血浆中直接找到新冠病毒的中和抗体,犹如难如登天,现在无法完结。横竖我不知道怎样做。

咱们需求走别的一个途径,那便是先找到发作抗体的细胞。离心后血浆下面的这层是白细胞,其间包含人体内两大免疫细胞,T细胞和B细胞。咱们今日只讲B细胞。

B细胞是出产抗体的,它发作于骨髓,通过血液和淋巴液散布到全身的淋巴结。可是B细胞品种繁复,每个B细胞只出产某一种特定的抗体;而这种抗体是由B细胞的DNA序列决议的。所以咱们选用的办法便是通过对B细胞进行RNA测序来找到咱们想要的中和抗体。

咱们寻觅新冠病毒中和抗体之路开端于大年初三,曹云龙在几个月前刚从哈佛拿到博士学位,他是我的哈佛试验室里仅有一个跟我回国的。咱们不是专门搞病毒或许免疫学的,单细胞基因组学是咱们的特长。一开端咱们仅仅想为抗疫做点什么,当知道到单细胞基因组学或许有或许协助找到中和抗体的时分,咱们十分振奋,立马开端读文献,拟定试验计划,四处寻觅仪器和试剂。北大和北京市各单位的搭档十分给力,所以很快就万事俱备。

2月2号,我和咱们中心的苏晓东教授、测序渠道负责人耿晨阳去了佑安医院。在这儿见到金院长和冯处长,他们当即就赞同协作,要供给恢复期患者的血样。紧接着医院的粟斌和郭向华研讨员来到咱们中心,完结单细胞测序技能的训练后就回到医院的P2+试验室,类似于P3试验室,所以他们要穿许多防护服这样的配备。按理每天只应该作业5个小时,但他们常常作业8、9个小时,乃至11个小时。为此他俩还被阻隔了整整两个月。

在进一步解说之前,我需求先给咱们一些布景常识。

谈到测序,咱们知道这次疫情迸发后,我国科学家在一个月内就测出新冠病毒的完好序列,并在榜首时刻向全球发布,为新冠肺炎的检测奠定了根底。比较之下2003年SARS迸发时,最早的序列用了5个月的时刻才测出来,是由加拿大的团队最早发布的。

就在SARS发作的同一年,人类基因组计划完结了,这是人类历史上的一个里程碑。其时一家美国的私家公司和美国安排的世界团队剧烈竞赛。私家队的队长Craig Venter测的是他自己的基因组,而美国领导的世界团队耗资30亿美金,测的是6、7个人的组合;其时我国参加了1%的作业。

在人体细胞的细胞核里有 46 条染色体,23 条来自于父亲,23条来自于母亲,染色体的首要成分是遗传物质DNA。咱们知道,二十世纪最巨大的生物学发现是Waston和 Crick的DNA双螺旋结构。DNA有四种碱基 A、T、C、G, A与 T 配对,C与G配对。简略地说,碱基摆放的序列决议了遗传信息,也便是基因。人类基因组有60亿对碱基,共有2万多个基因,对应两万多个蛋白质。人与人比较,绝大部分的碱基都是相同的,只需千分之一碱基序列的不同决议了咱们之间的不同。比方说这儿,这一个人体细胞里,来自父亲和母亲的DNA,他们的不同仅仅千分之一的碱基。

依照分子生物学的中心法则,DNA带着的遗传信息,即基因序列,用来在转录过程中由转录酶发作信使RNA,接着在翻译过程中由核糖体生成蛋白质。蛋白质是以氨基酸为基本单位的生物大分子,一共有二十种氨基酸,它们手拉手地接起来构成链状大分子,然后再折叠起来成为蛋白质,比方说Y字型的抗体蛋白。

蛋白质的组成遵从遗传暗码。三个的DNA碱基决议一个氨基酸。所以DNA的序列和蛋白质的序列有一一对应的联系。比方说,抗体蛋白是B细胞里的抗体基因通过转录和翻译的产品。

其实转录和翻译并不必定要在人体内进行,有了基因序列,咱们能够运用转录酶和核糖体在体外出产抗体蛋白。

17年曩昔了,生物基因检测技能有了日新月异的开展。今日我实践上便是想讲怎样运用这新技能处理当下的问题。

2007年发作了新一代DNA测序仪的革新,使得测序价格的下降速度比半导体工业的指数衰减还快。现在只需1000美元,在一天之内就能够完结个人基因组的测序。新一代测序仪使得个体化医疗成为或许。也便是说通过个人基因组的信息来了解病因,为医治和防备疾病供给个性化计划。

人类基因组和新一代测序仪之后的另一个革新是单细胞基因组学。也便是说你给我一个单个的人体细胞,我就能够告知你它整个的基因组。这是怎样完结的呢?现在还没有一种技能能够把一个细胞里的46根染色体每根从头读到尾,咱们需求把单细胞里的微量DNA扩增,然后用新一代测序仪来测序。

咱们或许听说过PCR,是30 多年前的一个DNA扩大技能,对生物学、医学有很大奉献,得了诺奖。PCR十分活络,在犯罪现场有一个DNA分子,PCR就能够把它扩大,测出信号。可是PCR有很大误差,有些基因被扩大的倍数很高,有些很低。用它来扩大整个的基因组,覆盖率只需5%。

2012年我的哈佛试验室发明晰一种单细胞扩增技能叫MALBAC。它的姓名很像红酒MALBEC。它大大提高了单细胞基因组扩增的均匀度、覆盖率和测序的精准度。后来咱们又发明晰一个更精准的扩增办法叫LIANTI,也是别的一个红酒的姓名。

那咱们为什么要做单细胞测序呢?我给咱们举一个实践运用的比方。咱们团队和北医三院的乔杰团队、北京大学的汤富酬团队协作,把这个技能用到生殖医学。在试管婴儿的过程中挑选没有遗传缺点的受精卵,以防止爸爸妈妈的遗传疾病遗传到下一代。这是2014年在北医三院诞生的首个“MALBAC婴儿”,一个十分美丽的女婴。咱们去看她的时分,一声都没哭,还一个劲冲我笑。迄今为止,在国内也有多于一千对配偶成功地防止了单基因遗传疾病的子孙传递。

单细胞的测序不只能够是基因组,并且能够是转录组,也便是一切被表达的信使RNA的序列。咱们中心的汤富酬教授十年前在英国做博士后的时分,初次用新一代测序仪测出了单细胞的转录组。转录组很重要,由于它决议了细胞的功用。一般来讲,不同品种的体细胞,它们的基因组都相同,但转录组不同,因而功用不同。

这是咱们最近和富酬等搭档一同协作的数据。每个点代表一个单细胞,点的方位不相同,由于它们的转录组不相同,表达量不相同。同一种细胞型的细胞会构成一个点簇,咱们用不同色彩符号不同细胞品种。单细胞转录组现已被广泛用于细胞分型。

咱们现在便是用这种单细胞转录的组试验给恢复期患者血液中不计其数的B细胞分型。咱们先把单个B细胞从血液里别离出来,然后测定每个细胞的转录组。相同这儿每个点代表一个B细胞,不同的色彩代表不同的B细胞品种。

人们知道B细胞是由骨髓发作的,从造血干细胞开端逐步老练,然后活化,最终变成浆细胞和回忆B细胞。这些不同的细胞品种咱们都能看到。咱们最重视的是回忆B细胞。

我刚说过,一般来讲,在一个人身上,不同器官的细胞都有相同的基因组和不同的转录组。可是B细胞在老练过程中,它的基因组是能够被重组的。为了这个发现,日本科学家Tonegawa在1987年获得了诺贝尔奖。在第14号染色体上,有VDJ三个区域。V区域有40个类似但不同的DNA序列,D有23个,J有6个序列。

当B细胞从不老练到老练状况改变的过程中,基因组开端重组,就像从V、D、J三套牌各抽出一张。这样转录和翻译发作的抗体就有许多种。有多少种呢?40x23x6 =5520种,但这还不是悉数。由于这个14号染色体仅仅组成重链(蓝色),而轻链(白色)是由在第2号或22号染色体上发作的。它们有 V和J,可是没有D。除了VDJ重组,还有碱基的随机骤变,都加在一同使得最终DNA序列的品种到达10的7~8次方种,为免疫系统供给了多样性。

抗体是用Y字型结构上的两把“钳子”,来捕捉抗原。这钳子嘴的形状以及与抗原结合的强度,取决于它氨基酸的序列。这儿我要着重,咱们特别需求单细胞的测序技能,由于每个B细胞通过V(D)J重组只发作某个特定的抗体蛋白。

奇特的是,这10的7-8种次方发作不同抗体的B细胞,在抗原还没有来的时分,现已在血液和淋巴液里发作了。而当某一种抗原到来后,与它结合的抗体是怎样被发现和富集的呢?

在B细胞在未老练到老练的过程中,这些抗体分子IgM被放在细胞的外表作为B细胞的受体(B-cell Receptor, BCR)。这些细胞一向不割裂,直到某个抗原,比方S蛋白,结合到BCR上,给这个B细胞一个信号,它就被激活了,开端细胞割裂,1变2,2变4,这种B细胞就被富集了。

然后被富集的B细胞演化成浆细胞和回忆B细胞。浆细胞排泄IgG抗体到血液和淋巴结。而回忆B细胞留在骨髓和淋巴结很长一段时刻。

由于回忆B细胞外表覆盖着BCR也便是细胞受体。咱们能够用新冠抗原把回忆B细胞从恢复患者的血里别离,出来测序。

回忆B细胞的IgG抗体和浆细胞排泄的IgG抗体,承受相同的抗原,由于它们两对钳子的可变区的序列和结构都是相同的,仅仅在这固定区序列和结构不同,由于它们用的是C区域序列,而不是V(D)J。

让咱们看IgM和IgG抗体跟着时刻的改变,榜首次感染后,3天内呈现IgM抗体,量不是太大,保存时刻不长。

趁便说一下,钟南山院士的团队的抗体检测便是检测IgM抗体。这办法很简略,只用手指上取一滴血就能够了。可是感染后有必要要等几天才干知道。

咱们想找的IgG一两个星期今后才出来。继续3、4周,之后会削减。所以咱们需求回访的出院患者需求在这个时刻段,假如恢复时刻太久了,IgG的量会越来越少。人类的免疫系统能够确保,假如第2次感染再发作的时分,免疫反响能够发作许多的IgG。

好,原理是这样的,试验怎样样?这是云龙和文洁,孙文洁是咱们中心的生物信息专家,他们拿到的一号患者数据。

这儿的六个回忆B细胞,它们的重链和轻链都有相同的V(D)J序列,他们来自同一个母细胞,也有随机的点骤变。咱们的假设是具有同一种V(D)J序列的细胞数目越多,该细胞越有或许有好的免疫功用。这成为咱们的榜首挑选规范。这个挑选规范在传统的单细胞克隆办法里,难以完结。由于咱们有高通量的单细胞测序,就能够运用这个假设来高效得挑选。

别的咱们拿到这个V(D)J序列,就能够在体外出产这个抗体。运用这个生物学的中心法则,咱们能够交给一个公司来做。

用这种办法咱们找到了一些与S蛋白有很强结合力的抗体,也找到了几个中和抗体。可是这种办法的功率仍是不够高,由于抗体的品种仍是太多了。

后来我曾经哈佛的博士生张旭加入了咱们。她把小磁珠跟S蛋白或RBD连接起来,用这块磁铁把能和S蛋白或RBD结合的回忆B细胞从血液中别离出来。这样一来功率就大大提高了。

找到抗体后咱们首要就测它的结合强度。抗体与S蛋白结合强弱是以结合常数来衡量的。(左图)横轴代表抗体在溶液中的浓度,竖轴代表与S蛋白的结合程度。抗体的浓度越高,结合程度就越高。当结合程度到达50%,抗体的浓度便是它与S蛋白的结合常数,这个抗体是40pM。这个数越低,标明结合强度越高。尽管听起来笼统,但这40pM对应每升血液里只需求打入6毫克抗体,当然是越低越好。

中和抗体需与ACE2竞赛。依据近来文献报导,ACE2与S蛋白结合常数是35nM(右图),比抗体与S蛋白的结合常数高得多,所以结合强度低得多。

但我想着重,抗体结合力强不必定有中和才能,还要看结合的是不是S蛋白上要害部位。所以咱们有必要要做病毒的中和试验。

郑英慧是咱们试验室做中和试验的能手。咱们先做的是假病毒试验,由于不需求P3试验室。这个横轴仍是中和抗体的浓度。当抗体浓度特别高的时分,在细胞培养液里的病毒与抗体结合,而不进入细胞,当抗体浓度低的时分能够看到它进去,病毒进入细胞通过荧光指示。当按捺强度到达50%的时分抗体的浓度被称作半按捺浓度,关于这个抗体咱们其时看到的是50pM,是0.008微克/毫升,这是模仿病毒在人的细胞体外试验。下一步便是到P3试验室看真的病毒被抗体按捺的状况。

这是最近从P3试验室得到的数据,让咱们十分高兴。这3个抗体的半按捺浓度都小于1μg/mL,(1-10nM)。这个试验首要是看细胞的逝世。左图中,抗体浓度较低时,细胞受感染而凋亡。右图中,在中和高抗体浓度的时分,病毒感染被有用按捺。

总结一下,咱们现已从70个恢复期患者血浆里的三十万个B细胞中,挑选出300个富集度最高的Ig G抗体序列。

依据这些序列现已出产出300个抗体蛋白,正在测验,现在已筛出一大批高结合强度的抗体(Kd=10 pM-10nM)和多个有超卓中和活性的抗体。

高通量单细胞转录组和VDJ测序,可直接检测B细胞的富集程度,使得咱们能够快速精准地挑选出许多优质的中和抗体。

后续的动物试验已在谋划中,临床试验是下一步。

挑选出的中和抗体有两个运用。一是能够用于新冠肺炎的中和抗体医治,更安全且针对性强。

二是用于短期防备,维护咱们的医护人员和患者家族,有用期大约3周,通过抗体改造有或许延伸至3个月。

国内别的几个团队也一向在寻觅中和抗体。咱们的方针都是共同的,期望找到最好的抗体,尽早成药!

咱们的作业为将来或许呈现的疫情做好了预备。用咱们的新办法,对病毒有杰出中和活性的抗体应该在十天之内就能够找到。

最终我想说,上一年八月,在中美贸易战, 以及我与美国科学家的协作受阻的布景下,我在Cell杂志宣布了这篇文章《Disease Has No Borders, Neither Should Research》。不出所料,这次疫情使人们自觉或不自觉地知道到,病毒的确没有国界,抗疫也应如此!现在我国住院的患者现已越来越少,咱们的临床试验也将要在疫情更为严峻的当地来进行。假如成药,咱们不会命名它为“我国抗体”,由于它的运用应该是没有国界的。

今晚我之所以能在这儿跟咱们共享,是由于我身边这些并肩作战的同伴,我的团队,还有协作者,许多都是疫情之后知道的。我也十分感谢北京市政府、北京市教委的大力支持和北京市科委的和谐协助!



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